基因工程详解（步骤及应用详解）

菜鸡 • 30 8 月, 2022 2:14 下午 • 掘金笔记

介绍

人体很神秘吗？其实跟一台电脑也差不了多少。电脑程序由0和1的代码组成，不同的组合方式让电脑能够实现不同的功能。

人其实也是由代码组成的，只不过比电脑多了2位，分别是A、G、C、T, 四种碱基按照特定顺序排列，就形成了我们独特的人类基因。

自从科学家们发现了基因的秘密，一个将改变人类进程的想法诞生了，因为如果人类掌握了改变基因序列的方法，不光各种疑难杂症将迎刃而解，人类还将第一次真正掌握自己的进化方向，主宰自己的命运。

一场基因编辑技术的大探索就此展开。

1960 年代之前：基因编辑的先驱

1953 年：发现双螺旋

我们今天熟悉的脱氧核糖核酸 (DNA) 的梯形结构称为“双螺旋”，由 James Watson 和 Francis Crick 于 1953 年发现，开创了现代生物学和遗传学研究。

这是遗传学最重要的里程碑之一，是未来生命科学领域的支柱。

1958 年：首次在试管中制造 DNA

斯坦福大学医学院教授Arthur Kornberg 大约从 1950 年代初开始从事 DNA 合成的研究。1953 年，他从细菌提取物中分离出 DNA 聚合酶，并在一年内首次在体外成功合成了 DNA 。Kornberg因这一杰出成就获得诺贝尔奖。

1960 年代：连接 DNA

1967 年：将 DNA 片段连接在一起

DNA 连接酶的发现被认为是分子生物学的一个关键点，因为这对于理解所有生物中 DNA 的修复和复制至关重要。

本质上，催化磷酸二酯键的形成让 DNA 链连接在一起。这为 1960 年代和 1970 年代早期的基因剪接实验铺平了道路。

1968 年：发现限制酶

瑞士微生物学家Werner Arber假设细菌细胞产生两种类型的酶：一种称为“限制性”酶，可以识别和切割外源 DNA，另一种称为“修饰”酶，可识别宿主 DNA 并保护其免受切割。这一假设在一项从大肠杆菌分离这两种酶的实验中得到证实。

1970 年代：基因工程意外起飞

1970 年：限制酶的纯化

约翰霍普金斯大学医学院的分子生物学家Hamilton Othanel Smith在1972 年，成功地从流感嗜血杆菌中纯化出II 型限制性内切酶。

进一步了解了限制酶如何“切割”DNA 以及宿主 DNA 如何保护自身，这是当代基因工程疗法和 CRISPR 的基础。

1971 年：基因剪接实验为重组 DNA铺平了道路

斯坦福大学教授Paul Berg证明了任何两个 DNA 分子都可以连接在一起的理论有效性。这一成就被认为是基因工程领域的关键一步。

Paul Berg因“对核酸生物化学的基础研究和重组 DNA 的研究于 1980 年获得诺贝尔化学奖。

1972 年：创建重组 DNA (rDNA)

这些关于 DNA 的实验催生了重组 DNA (rDNA) 的产生。rDNA 本质上是由来自不同生物体的 DNA 组合而成的 DNA。科学家通过将遗传物质从一种生物体注入另一种生物体中来达到这一目的，这一发现确立了现代遗传学原理，是未来实验的基础。

1974 年：美国国家科学院暂停基因工程实验

随着基因编辑技术的发展，美国国家科学院认为这些实验存在伦理上的危险。他们在 1974 年提议暂停所有基因工程实验。

重组 DNA 先驱Paul Berg认为该领域的研究至关重要，于 1975 年 2 月组织了Asilomar 会议，有 100 多名科学家参加了会议。在这次会议上，围绕基因实验的许多伦理问题得到了解答和规范，至今仍被现代基因工程相关人员所坚持。

1980 年代：在植物、动物和人体上的初步应用

1981 年：第一个转基因动物

转基因动物是将来自外来生物的基因有意插入到动物的基因片段中。转基因动物首先始于1981 年俄亥俄大学Thomas Wagner领导的一个研究小组。

Wagner和他的团队使用一种现在被称为“DNA 显微注射”的方法，将兔子的基因转移到了小鼠基因组中。他们实验的成功为随后几年的转基因动物实验铺平了道路。

1982 年：第一个基因工程人类药物 – 合成胰岛素

基因泰克作为一家从事生物技术研发40 多年的公司，将世界上第一种基因工程药物——人造胰岛素——推向了市场。在这之前，胰岛素是从动物身上提取的，虽然与人胰岛素相似，但动物胰岛素还是有一些显著差异。

这被认为是基因泰克历史上的关键性时刻，也是基因工程药物被批准上市的原点。

1983 年：聚合酶链式反应 (PCR) 的发展

聚合酶链反应 (PCR) 的发现在后来的 DNA 实验中不可或缺，因为它被用来制作特定 DNA 片段的副本。通过链式反应，DNA 序列可以被复制成千上万份。

1985 年：发现锌指核酸酶 (ZFN基因编辑技术)

锌指核酸酶 (ZFN) 的发现提高了基因靶向的有效性。研究人员将 DNA 切割酶与 ZFN DNA融合，形成“基因组剪刀”，可以在特定位置切割 DNA，在 DNA 中产生双链断裂 (DSB)。

借助 ZFN 基因分离方法，我们能够确定导致突变的确切基因，并对其进行针对性攻击。

1988 年：第一批 Bt 玉米出现

1988 年是美国第一次（正式）在田间实际出现转基因作物，这种作物是玉米。这种玉米被称为“Bt 玉米”，因为它含有来自苏云金芽孢杆菌(Bt)细菌的基因，提高了玉米抵抗害虫的能力。

1990 年代：克隆和转基因生物

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1993 年：CRISPR 原理的发现

CRISPR (Clustered regular interspaced short palindromic repeats) 原理最初由Francisco Mojica在圣波拉沼泽地研究细菌时意外发现，Mojica发现细菌中的部分 DNA片段有规律的重复了很多次。

在接下来的 10 年中，Mojica继续深入研究这些重复序列，直到 2003 年他发现，重复 DNA 片段与那些攻击细菌的病毒的 DNA 片段相匹配。这项发现极大促进了之后DNA的相关研究，也让 CRISPR 基因编辑工具成为当今遗传学研究的前沿。

1996 年：多莉羊的克隆

这是科学界有史以来传播最广的故事之一，“多莉”绵羊于 1996 年被克隆出来。作为第一个从成体细胞克隆出具有相同遗传特性的哺乳动物，多莉绵羊是遗传学的里程碑事件

1999 年：人类完成首个染色体测序

1988年，美国国会资助了人类基因组计划，旨在绘制出人类完整基因组。尽管这项努力直到 2003年才完成，但在 1999 年，参与该项目的科学家证明他们已经完全绘制了 22 号染色体的序列。

这是该计划的一个里程碑，证明了投入到该项目中的大量时间和努力并非徒劳。

如今，科学家们已经对数以千计的生物的基因组进行了测序和注释，并且测序成本大大降低，检测每个人体基因组的成本仅为几百美元。

2000 年代：从实验室走入医院

2001 年：首个基因靶向药物疗法获批

在 2001，称为格列卫的靶向基因治疗药物获得了美国 FDA 的批准，用以治疗慢性粒细胞白血病 (CML)，至今仍被用作治疗该癌症的有效药物。

2006 年：FDA 批准首个预防性癌症疫苗

2006 年，在使用基因编辑寻找癌症疗法上取得了突破性进展。Gardasil是第一个进入市场的预防性癌症疫苗。当时，它仅被批准用于 9-26 岁的女性，但在 2009 年，它也被批准用于 9-26 岁的男性。

到 2018 年，Gardasil 被批准用于 9-45 岁的男性和女性。迄今为止，这种 HPV 疫苗仍然是唯一的预防性癌症疫苗。

2006 年：第一个诱导多能干细胞 (iPSC)

胚胎干细胞有分化成任何细胞类型的能力。然而，使用干细胞开发疗法需要从试管婴儿的胚胎中分离细胞。

2006年，加州大学旧金山分校的山中伸弥博士率先发明了诱导多能干细胞（iPSC）技术。使用这项技术，可以将干细胞分化为任何特定的细胞类型。

2010-2020：基因编辑的新时代

2011 年：发明TALEN基因编辑工具

虽然1985年 ZFN的发现让基因编辑变成了可能，但这项技术实施起来耗时长，且容易产生脱靶效应。

2011 年，TALEN基因编辑工具诞生。与 ZFN 相比，TALEN 可以在几天内设计和制造完成。

TALEN 似乎对基因组位点的限制较少，可以轻松地在整个基因组中定位，并且脱靶效应比 ZFN 少，对宿主细胞的毒性也更小。

虽然 TALEN 与 ZFN 相比具有明显的优势，但它们也表现出一些缺点。例如TALEN的体积明显大于 ZFN，因此在体内递送和表达时更困难。

2012 年：发明 CRISPR 基因编辑工具

2012 年，Jennifer Doudna、Emmanuelle Charpentier 和他们的团队阐明了 CRISPR 技术的生理机制和工作原理。CRISPR 基因编辑技术的用途多种多样，从癌症治疗到解决肥胖症或是制造无脂奶牛等等。无论是诊断、治疗还是其他方面，每天都有新的发现来到这个前沿领域。

CRISPR-Cas9 本质上是一种细菌适应性免疫系统，可以通过设计与目标序列互补的向导RNA 来实现对DNA的编辑。入侵病毒的 DNA 片段被细菌核酸酶（CRISPR 相关蛋白）剪断。被切断的 DNA 片段可被用来抵御未来的病毒入侵。

2015 年：用 CRISPR 编辑人类胚胎

2015年，广州中山大学的遗传学家黄俊久利用CRISPR技术编辑了人类胚胎。由于黄俊久的实验已经改变了影响遗传的生殖细胞，被学术界认为是不道德的，引起了巨大争议，被西方科学期刊拒绝刊登。直到2018年，才有部分机构批准了CRISPR相关的人体试验。

2017 年：首个癌症 CAR T 疗法获得批准

2017 年，批准了两种 CAR T 细胞疗法：一种用于儿童急性淋巴细胞白血病，一种用于成人晚期淋巴瘤。

这是 CAR T 疗法的一大进步，如果治疗证明如预期的那样有效，则可能会取代化疗成为癌症治疗的主要形式，因为 CAR T 对人体无毒，并且已经证明可以在短短 10 天内完全消融癌症肿瘤。

2018 年：首次 CRISPR 人体试验获得批准

在Vertex Pharmaceuticals和CRISPR Therapeutics两家公司的联合倡议中，一种用于治疗地中海贫血症的CRISPR疗法已被批准开始临床试验。

2019 年：Prime Editing 使单链切割成为可能

2019 年 10 月, Broad研究所David Liu教授研究团队在 Nature上发表了一篇关于新型基因编辑工具Prime Editing的论文。

这种新颖的基因编辑技术可以在增加编辑精确性的同时减少负面影响。该工具与 CRISPR 的不同之处在于它能够在不造成双链断裂的情况下进行基因编辑。

2020 年：属于CRISPR 的一年